בדיקת PCR

מקסימיליאן ריינדל למד כימיה וביוכימיה ב- LMU במינכן וחבר בצוות המערכת של מאז דצמבר 2020. הוא יכיר עבורך נושאי מדיניות רפואית, מדעית ובריאותית על מנת להפוך אותם למובנים ומובנים.

פוסטים נוספים של Maximilian Reindl כל תוכן נבדק על ידי עיתונאים רפואיים.

בדיקות PCR הפכו לחלק הכרחי ברפואה המודרנית ובאבחון מולקולרי. מכיוון שהם כה מדויקים, הם נחשבים ל"סטנדרט הזהב ". ניתן להשתמש בהם במגוון רחב של יישומים, החל מאיתור פתוגנים וכלה בסינון למחלות תורשתיות - כלומר בכל מקום בו יש צורך באיתור אמין ולו עקבות הקטנים ביותר של חומר תורשתי. גלה כאן מדוע בדיקת ה- PCR כה מדויקת, היכן היא משמשת וכיצד היא פועלת בפירוט.

מהי בדיקת PCR?

בדיקת PCR היא שיטת מעבדה מביולוגיה מולקולרית ורפואה. הבדיקה משמשת לגילוי ישיר - ואפיון - של חומר גנטי. שיטת ה- PCR נחשבת על ידי מומחים לקלה לביצוע, ישימה אוניברסלית וחזקה.

במעבדה, בדיקת PCR מורכבת משני שלבים. בשלב הראשון, החומר הגנטי הקיים משוכפל בעזרת תגובת שרשרת הפולימראז, או בקיצור PCR. בדרך זו ניתן לבדוק את עקבות ה- DNA הקטנים ביותר. זו גם הסיבה לכך שבדיקות PCR כל כך רגישות.

בשלב שני, החומר הגנטי מופרד, "ממיין" וכך מתאפיין בהתאם לתכונותיו. אז המבנה הדק של ה- DNA נקבע.

ישנם שימושים אפשריים רבים: רופאים משתמשים בבדיקת PCR כדי לבדוק, למשל, מריחות לנגיף קורונה, תרומות דם לאיידס או בדיקת תינוקות לאיתור מחלות תורשתיות אפשריות. זיהומים חיידקיים - למשל עם פתוגן השחפת - או זיהומים טפיליים (מלריה) ניתנים להבהרה גם באמצעות ה- PCR.

הם גם מסייעים ברפואה משפטית להרשיע עבריינים על סמך טביעת האצבע הגנטית שלהם או משמשים כבדיקות אבהות.

כל היישומים הללו מסוכמים תחת המונח אבחון מולקולרי. ה- PCR מוצא אפוא יישום מעשי במחקר, אבחון וזיהוי פלילי הרבה מעבר לגילוי הפתוגן Sars-CoV-2.

בדיקת PCR (קורונה) מול בדיקת PCR מהירה

בדרך כלל, הערכת בדיקת PCR מתבצעת במעבדה מיוחדת. המשמעות היא שחומר המדגם נשלח ונבדק שם. התוצאה מתקבלת בדרך כלל כעבור מספר ימים.

חברות הזנק שונות (GNA Biosolutions, Spindiag) הציגו לאחרונה סוגים חדשים של מכשירי בדיקה ניידים. על כך הם קיבלו גם אישורים מיוחדים מהמכון הפדרלי לתרופות ומכשירים רפואיים (BfArM). בעזרת התקני בדיקת PCR ניידים אלה, בדיקת PCR תתאפשר גם ללא מעבדה מיוחדת.

לגישה זו יש פוטנציאל רב, שכן תוצאת בדיקה אמינה עשויה להיות זמינה תוך מספר שעות ישירות במיקום בו נלקחה המדגם (מרכז הבדיקה).

עדיין לא ניתן להעריך עד כמה מערכות הבדיקה המהירות של PCR כאלה ינהגו בפועל. כמו כן, עדיין לא ידוע כמה מהר יסופקו מרכזי הבדיקה למכשירים אלה על פני הלוח.

בעתיד הנראה לעין, לכן יימשכו בדיקות PCR מבוססות מעבדה "רגילות", הגורמות לעיכוב מסוים בין הדגימה לתוצאת הבדיקה.

עד כמה בדיקת PCR אמינה?

PCR היא שיטת זיהוי מוכחת באבחון מולקולרי ורפואה. הוא נחשב לתקן הזהב כביכול עם שיעור שגיאות נמוך מאוד. הבדיקות מתאפיינות במיוחד ברגישות וספציפיות גבוהות מאוד.

רגישות פירושה האמינות שבה בדיקה מוצאת את החומר הגנטי שיש לאתר.

ספציפיות פירושה הוודאות שבה הבדיקה קובעת שהחומר הגנטי המדובר אינו קיים במדגם.

מתי בדיקות PCR פועלות במקרה של זיהום Sars CoV-2?

ככלל, בדיקת ה- PCR מאתרת זיהום קורונה יומיים עד שלושה ימים לפני ועד 20 ימים לאחר הופעת התסמינים. אפילו עם אנשים נגועים שנשארים נטולי סימפטומים לחלוטין, הבדיקה פועלת בחלון זמן קריטי כאשר הם יכולים להדביק אחרים.

במקרים בודדים, הוכחה לכך אפשרית אף 60 יום לאחר הופעת תסמיני המחלה.

ביום הראשון לאחר זיהום קורונה, גם בדיקת PCR יכולה להיות שלילית, למרות שיש זיהום. במקרה כזה, לא היו מספיק וירוסים בגרון בזמן בדיקת המריחה. עם זאת, אם יש חשד סביר לזיהום, הרופאים בדרך כלל מבצעים בדיקת PCR נוספת בימים הבאים.

מקורות טעות אפשריים

שיעור השגיאות בתהליך העתקת ה- DNA זניח בפועל. למרות שהפולימראזות של DNA אף פעם לא פועלות כראוי, הן כמעט ולא ממלאות תפקיד בתהליך בדיקת ה- PCR.

בפועל, מקורות הטעות האפשריים נעוצים בתהליך הדגימה: לכן חשוב שצוותים רפואיים מאומנים יבצעו את המריחות. דגימות רוק וגרגור עלולות להפחית את הדיוק, מכיוון שמתרחשות כאן השפעות דילול.

כיצד פועלת בדיקת PCR?

בדיקת PCR מתבצעת, למשל, על ידי רופא המשפחה או במרכזי בדיקה מיוחדים. ראשית, רופאים או אנשי מקצוע בתחום הבריאות לוקחים מדגם. בדרך כלל, נלקחת ספוגית מנתיב האוויר העליון לצורך הבדיקה. זה בדרך כלל לובש צורה של משטח פה או אף וגרון.

אפשר גם לגרגר עם תמיסת שטיפה. דגימת דם אינה אופיינית לגילוי קורונה - אך נפוצה, למשל, בהקרנה של יילודים.

ללא קשר לסוג הדגימה שנלקחה, חומר גנטי נמצא על ספוגית הכותנה, בתמיסת השטיפה או בטיפת דם. חומר מדגם זה נשלח למעבדה, שם הוא מבודד ומטהר.

בדיקת PCR מחולקת לאחר מכן לשני שלבים:

• PCR: בשלב זה, כמות החומר הגנטי המקורי מוכפלת.
• אלקטרופורזה: בשלב השני, קטעי הגנום "ממוינים" לפי גודל. באופן זה ניתן לאפיין את המדגם - נקבע המבנה הדק של החומר הגנטי.

שלב 1: PCR - "תגובת שרשרת הפולימראז"

ה- "PCR" הוא הראשון מבין שני שלבי העבודה: כאן מוכפלת כמות ה- DNA ההתחלתי הקיים. כי רק כאשר החומר הגנטי זמין בכמות מספקת ניתן לבחון אותו. לרוב זהו DNA אנושי; בדיקות לנגיף הקורונה הן בהתאם ל- RNA של וירוס.

הקיצור PCR מייצג את המונח האנגלי "Polymerase Chain Reaction".

מה נחוץ ל- PCR?

ה- DNA ההתחלתי ממוקם בכלי תגובה עם חומרים מיוחדים. החומר הגנטי הקיים משמש כתבנית, המועתקת בנוכחות אנזימים מסוימים (טאק פולימראז) ואבני בניין בסיסיות של DNA.

תהליך ההעתקה מתרחש במספר ריצות (חוזרות) שחוזרות על עצמן.

באופן ספציפי, החומרים הבאים משולבים:

• DNA מתחיל: חומר מדגם שיש לשכפל.
• אבני בניין בסיסיות DNA: אלה הם הנוקלאובאזים אדנין, תימין, ציטוזין וגואנין.
• פולימראז DNA: אנזים המקשר אבני בניין בודדות של DNA ליצירת קווצת DNA מוגדרת היטב. הגדיל שהתקבל הוא תמונת מראה (משלימה) של חומר המוצא המקורי.
• פתרון מאגר: תגובת שרשרת הפולימראז מתרחשת בתמיסת חיץ פיזיולוגית. זה מבטיח תנאים דומים לאלה שנמצאים בתאים אנושיים. פתרון זה שומר על יציבות ה- pH ומכיל גם יוני מגנזיום. תנאים מבוקרים אלה נחוצים להבטחת הפונקציונליות של פולימראז ה- DNA.
• פריימרים: הם מורכבים מ 16 עד 24 זוגות בסיס ומשמשים עמדת התחלה ואות התחלה. פריימרים מראים את פולימראז ה- DNA בנקודה (של ה- DNA ההתחלתי) תהליך ההעתקה מתחיל.

כיצד מתבצעת בדיקת PCR?

מכיוון שכל החומרים הנדרשים ל- PCR נמצאים כעת בכלי התגובה, תהליך ההעתקה בפועל של החומר הגנטי יכול להתחיל. זה רק מתחיל, נשלט ונעצר שוב על ידי הטמפרטורה.

כלי התגובה מחומם או מקורר באופן ממוקד לטמפרטורות שונות. זה נעשה עם מכשיר מיוחד - מה שנקרא מחזור תרמי. התגובה הכוללת אורכת כשעה עד שעתיים.

השלבים האישיים של מחזור PCR הם:

• דנטורציה של הגדילים הכפולים של ה- DNA: הדגימה מחוממת ל -90 מעלות צלזיוס. כתוצאה מכך, גדיל הכפול המקורי של ה- DNA מתפרק לשני גדילים בודדים (משלימים).
• הצמדת הפריימר: הטמפרטורה יורדת מעט מתחת ל 60 מעלות צלזיוס. כתוצאה מכך, הפריימרים (פריימרים קדימה, פריימרים הפוכים) מתחברים למיקומים מוגדרים בחוטים היחידים המקבילים של ה- DNA.
• הרחבה: הטמפרטורה מוגברת למעט מעל 70 מעלות צלזיוס. פולימראז ה- DNA מתחיל כעת את עבודתו בטמפרטורה אופטימלית זו. הוא מתחבר לעמדות הפריימר ומאריך את הגדיל היחיד המקורי של ה- DNA צעד אחר צעד עד שיהיה זמין עותק מדויק (משלים) (סינתזת DNA).

לאחר מחזור שהושלם, הטמפרטורה שוב עולה ל -90 מעלות צלזיוס - המחזור מתחיל מחדש.

באמצעות שיטת ה- PCR, ניתן לשכפל רצפי DNA עד כשלושה זוגות קילובייס (kbp). זה מתאים לכ -3,000 אבני בניין בסיסיות של DNA המקושרות ליצירת "שרשרת". לשם השוואה: הגנום האנושי אוגר את התכניות והמידע לפעולת התא בכשלושה מיליארד זוגות בסיס - הגנום של וירוס הקורונה, לעומת זאת, מורכב מ -30,000 זוגות בסיס. ניתן להשתמש בבדיקת PCR רק כדי לשכפל ולבחון חלקים קצרים מתוך ה- DNA הכולל.

הפריימרים הם מכריעים

בחירת הפריימרים הינה קריטית לתהליך ה- PCR. באבחון Sars-CoV-2, למשל, משתמשים במספר פריימרים (PCR multiplex).

בדיקות ה- PCR של קורונה מחפשות שלושה גנים שונים של וירוסים: הספציפיות הכוללת עולה לכמעט 99.99%. המשמעות היא שעם שיעור פגיעות גבוה זה, יש רק בדיקה חיובית כוזבת אחת לכל 10,000 בדיקות (אם המדגם נלקח נכון).

כמה חומר גנטי מועתק יש עכשיו?

נניח שאחרי המחזור הראשון ישנם שני גדילים כפולים זהים של DNA.

לאחר כל מחזור, כמות החומר הגנטי (שהועתק) מכפילה את עצמה. כך שכמות ה- DNA גדלה באופן אקספוננציאלי.

במילים אחרות: לאחר המחזור השני ישנם ארבעה גדילים כפולים זהים - לאחר המחזור השלישי שמונה גדילים כפולים - לאחר המחזור הרביעי 16 גדילים כפולים ולאחר המחזור החמישי כבר 32 גדילים כפולים.

רופאים בדרך כלל חוזרים על תהליך זה כעשרים עד שלושים פעמים.

מבחינה מטפורית, פירוש הדבר: גם אם רק בתחילת הדגימה היה נמצא גדיל DNA כפול בודד, לאחר עשרים מחזורים כבר יהיו מיליון עותקים זהים בכלי התגובה.

מה המשמעות של ערך Ct?

מספר מחזורי ה- PCR שהושלמו ניתן בצורה של מה שנקרא ערך Ct. "Ct" נגזר מהמונח האנגלי "סף מחזור". ערך Ct זה מאפשר הצהרות לגבי כמות החומר הגנטי שאותו מחפשים.

בערך Ct נמוך של 20, יש הרבה חומר גנטי מתחיל. עם זאת, אם ערך ה- Ct גבוה - בסביבות 30 מחזורים - יש מעט DNA בהתאם. לכן יש לעבור את מחזור ה- PCR לעתים קרובות יותר.

שלב 2: אלקטרופורזה "מיון לפי גודל"

לבסוף, אם יש מספיק חומר גנטי "מועשר", יכול להתרחש מה שמכונה אלקטרופורזה. מדענים משתמשים במאפיין מסוים של DNA: המטען החשמלי שלו.

אבני הבניין האינדיבידואליות מקושרות זו לזו באמצעות עמוד שדרה סוכר-פוספט טעון (שלילי). ככל שרצף DNA מסוים ארוך יותר, כך המטען החשמלי שלו גבוה יותר.

אם החומר הגנטי מונח במדיום נשא ספציפי (agarose) ומופעל מתח חשמלי, מקטעי ה- DNA מתחילים לנוע בשל המטען שלהם. מכיוון שקטע DNA ארוך יותר נוסע מהר יותר משבר קצר יותר, הם נפרדים לפי הגודל.

באופן זה ניתן לבחון ולאפיין את החומר הגנטי. בפועל, מדגם לא ידוע עם הפניה ידועה מוחל בדרך כלל על "קו התחלה" ומשווה אחד את השני לאחר פרק זמן מסוים.

אם "מהירות ההגירה" זהה לשני הרצפים, המשמעות היא: הגילוי סביר מאוד חיובי - הגן שאתה מחפש כלול במדגם.

מקרה מיוחד לקורונה: הכנת דגימות ו- RT-PCR

זיהוי הפתוגן לנגיף הקורונה הוא מקרה מיוחד. Sars-CoV-2 הוא אחד מנגיפי ה- RNA המכונים. המשמעות היא שהגנום של Sars-CoV-2 הוא בצורה של RNA (חומצה ריבונוקלאית).

RNA שונה מה- DNA רק בכמה דרכים. בין היתר, הוא זמין כחוט אחד והוא מבוסס על הסוכר ריבוז במקום על דאוקסיריבוז 2 ". התימין של נוקליאובאז הוחלף גם ב- uracil כבסיס הרביעי.

יש "לתמלל" את ה- RNA הנגיפי הזה ל- DNA לפני בדיקת PCR רגילה. תהליך זה נקרא שעתוק הפוך (RT) - ומכאן המונח RT -PCR. במהלך תהליך זה מתקבל גדיל cDNA יחיד ("DNA משלים"). בשלב נוסף, גדיל ה- cDNA היחיד מתווסף על ידי גדיל DNA שני הפוך למראה.

בסוף הכנת הדגימה, יש גדיל כפול DNA המתאים לתוכנית המקורית של ה- RNA של הנגיף: רק גדיל כפול זה יכול לשמש כעת כתבנית בבדיקת PCR.

כמה זמן לוקח להגיע לתוצאה?

לאחר שליחת הדגימה למעבדה, בדרך כלל תקבל תוצאה לאחר יום עבודה או יומיים.במרכזי בדיקות, שלעתים קרובות בוחנים את הדגימות באתר, זה יכול לקחת רק כמה שעות. פרק הזמן תלוי במידה רבה במרכז הבדיקות המתאים לוגיסטיקה שלו.

למרות תהליכי העבודה המורכבים, מעבדות מודרניות מסוגלות לבצע בדיקות PCR עם תפוקה גבוהה. מכשירים אוטומטיים מיוחדים מסייעים ביישום.

בדיקת ה- PCR עדיין נחשבת לשיטת זיהוי "איטית" יחסית אך אמינה יותר.

מה קורה אם התוצאה חיובית?

אם הדגימה נלקחת כראוי, בדיקת PCR חיובית פירושה כי האדם הנבדק סביר מאוד להידבק ב- Sars-CoV-2.

אם קיבלת אישור שנדבקת בנגיף הקורונה בעזרת בדיקת PCR, משרד הבריאות יקבל הודעה מהמעבדה המתאימה לגבי תוצאת הבדיקה החיובית. במקרה כזה, משרד הבריאות יורה על בידוד או הסגר.

האם אני מדבק באופן אוטומטי אם אני מקבל בדיקת PCR חיובית?

רוב הזמן כן. אבל לא תמיד. תמיד יש לפרש תוצאה של בדיקת PCR בהקשר. בדיקה חיובית פירושה בעיקר שיש לך חומר ויראלי בך.

אם רק לאחרונה סבלת מ- Covid 19 (כמה ימים), בדיקת PCR עדיין יכולה להיות חיובית - למרות שאתה כבר בריא שוב. זהו מקרה מיוחד והחיסרון של בדיקה רגישה ביותר, שכן היא יכולה לזהות גם שברי וירוס שאינו יכול להתרבות.

בדיקת נוגדנים משלימה מועילה לפעמים

במקרים כאלה, בדיקת נוגדנים מספקת ודאות המבטיחה את תוקפו של בדיקת ה- PCR. עדיף לדון בזה עם הרופא שלך. הם יכולים לעזור לך לפרש נכון את תוצאת בדיקת ה- PCR.

מה לעשות אם התוצאה שלילית

תוצאה שלילית של בדיקת PCR פירושה בהסתברות גבוהה שלא נדבקת ב- Covid-19 כאשר הדגימה נלקחה ולכן אינך מדבק כרגע. עם זאת, אתה יכול להיות בשלבים מוקדמים של זיהום.

בדרך כלל, זיהוי קורונה ניתן לאתר רק מהיום השני או השלישי לאחר ההדבקה. אז התוצאה היא לא כרטיס חינם. לכן עליך להמשיך ולשמור על כללי המרחק וההיגיינה ולהמשיך לחבוש מסיכת FFP2 - לעצמך ולהגנה על אחרים.

בדיקת PCR בילדים

בדיקת PCR לילדים אינה שונה מבדיקת PCR למבוגרים. הן הדגימה והן פרשנות התוצאות חלות על ילדים ומבוגרים כאחד.

מהם הסיכונים בבדיקת PCR?

בדיקת PCR אינה מהווה סיכונים פיזיים. רק הדגימה על ידי ספוגית אף -גרון נתפסת בעיני אנשים כמעצבנת או לא נעימה.

כמה עולה בדיקת PCR?

כל העלויות שנגרמו לבדיקת PCR יכוסו אם הרופאים המטפלים שלך או משרד הבריאות מאשרים בדיקה כזו. החזר עלויות נחשב בדרך כלל אם יש לך כבר סימפטומים משלך או שהיה לך קשר ישיר עם אנשים נגועים.

גם במקרה של בדיקה מהירה או בדיקה עצמית חיובית, אתה זכאי לבדיקת PCR בחינם.

שימו לב: אם בדקתם את עצמכם בבית וקיבלתם תוצאה חיובית, עליכם לקבוע תור לרופא המשפחה באופן מיידי באמצעות הטלפון. הרופא המטפל ידון איתך בהליך הנוסף בטלפון.

לחלופין, עדיף להתקשר ל 116 117 כדי להירשם לבדיקת PCR. עד למבחן האישור, עליך להישאר בבית באופן אידיאלי כדי להגן על עצמך ועל אחרים.

none:  סמים מקום עבודה בריא שיניים